Đối với Francis, ông có nhiều lo sợ sau khi Charles được chọn làm người
kế vị. Một bản danh sách những mối thâm thù có liên quan với nhau giữa hai
nhà cai trị - về Navarre (thuộc sở hữu của vương triều Hapsburg, nhưng
Pháp tuyên bố chủ quyền), Burgundy (thuộc sở hữu của Pháp, nhưng
Charles tuyên bố chủ quyền) và quyền kiểm soát Công quốc Milan - có
nghĩa rằng lợi thế mới được tạo lập của Charles sẽ tạo ra mối đe dọa nghiêm
trọng tới quyền lực của Pháp. Điều này cũng tạo ra viễn cảnh Pháp bị bao
vây bởi các vùng đất của vương triều Hapsburg.
Ảnh hưởng của vị vua Tây Ban Nha và nỗi lo lắng của các nước láng
giềng gia tăng khi ông củng cố sự cai trị của mình tại những vùng lãnh thổ
do vương triều Hapsburg kiểm soát nằm bên trong Đế chế La Mã Thần
thánh, tại Hà Lan, các vùng lãnh thổ ở Franche-Comté và tại nước Ý ngày
nay, cũng như đế chế của Tây Ban Nha tại Tân Thế giới. Như sử gia John
Lynch đã nhận xét: “Dù Charles V có mong muốn thiết lập một đế chế toàn
cầu hay không, thậm chí nếu không tính bất cứ vùng lãnh thổ đang tranh
chấp nào - như Milan và Burgundy - thực tế vẫn là các khu vực cai trị của
ông đã quá rộng lớn, ảnh hưởng tới quá nhiều lợi ích và tạo ra sự phẫn nộ ở
khắp mọi nơi.” Theo sử gia Robert Knecht, Francis đã nêu ra những lo ngại
trên trước khi Charles đăng cơ và mong muốn bước lên vị trí đó chủ yếu bởi
vì “nếu Charles thành công, chứng kiến sự mở rộng của các vương quốc và
lãnh địa của hắn, điều này có thể gây ra những thiệt hại không thể đong đếm
được cho ta”.
Trong nỗ lực nhằm đảo ngược sự trỗi dậy của Charles, Francis ép các
đồng minh tiến hành xâm chiếm các vùng đất nằm dưới sự kiểm soát của
vương triều Hapsburg tại Navarre (một phần của khu vực ngày nay là Đông
Bắc Tây Ban Nha và Tây Nam Pháp) và Luxembourg. Charles đã phản ứng
lại bằng cách kêu gọi sự ủng hộ của Anh và Giáo hoàng nhằm chống lại sự
hung hãn của Pháp, đồng thời thành công trong việc xâm lược các vùng đất
của Pháp tại Ý. Francis bị bắt vào năm 1525 trong trận Pavia và bị giam giữ
ở Madrid. Để được thả, ông đã phải từ bỏ các yêu sách của mình ở Ý,
Burgundy, Flanders và Artois trong Hiệp ước Madrid năm 1526. Sức mạnh
