nhưng đời tư của Koch hoàn toàn không được như ý cho tới khi ông gặp được cô Hedwig Freiberg mới
17 tuổi, và ông li dị người vợ đầu tiên. Vào thời điểm này, cô con gái là Gertrude đã cưới phụ tá nghiên
cứu của ông là Eduard Pfuhl.
Chuyện tình lãng mạn giữa một nhà khoa học tiếng tăm và cô người mẫu trẻ đã dấy lên một “cơn bão đạo đức” trong cộng đồng khoa
học và y học. Tại hội nghị Các Thầy thuốc Đức năm 1892, người ta thích thú nhiều vì những câu chuyện phóng túng của Koch hơn là các
bài báo khoa học. Koch đã 50 tuổi, còn cô Hedwig mới 20 khi họ cưới nhau vào năm 1893. Bực mình vì cộng đồng y học hoài nghi thuyết
bệnh là do vi trùng gây ra, Koch tin rằng muốn tiến bộ thì phải tìm ra các phương pháp tin cậy để có được các canh cấy thuần khiết. Cơ thể
động vật có thể là một công cụ tối ưu để nuôi cấy các vi trùng gây bệnh, nhưng các nhà vi trùng học buộc phải nuôi cấy những chủng thuần
khiết bên ngoài cơ thể nhằm chứng minh vai trò gây bệnh của vi trùng. Thấy rằng hầu như không thể nào tạo được một môi trường chung
phù hợp cho tất cả các vi trùng, Koch tìm ra một phương pháp có thể chuyển đổi các canh thang (nutrient broth) thành dạng đặc trên đó các
khuẩn lạc tụ lại thành từng đảo, thay vì giống như các khuẩn lạc vi nấm thường thấy trên bánh mì cũ hoặc khoai tây. Các kiến thức về nấu
ăn từ xa xưa đã giúp giải quyết vấn đề khi thay gelatin bằng chất thạch agar-agar. (gelatin chảy thành nước ở thân nhiệt bình thường 37oC;
nhiều loại vi trùng tiêu hóa được gelatin; còn agar là chất trơ khi vi trùng tiêu hóa và vẫn cứng khi nhiệt độ lên đến 45oC). Việc sử dụng
thạch agar để phân lập các khuẩn lạc vi trùng còn được gọi là “Kỹ thuật đĩa thạch của Koch”. Koch cho rằng để nghiên cứu các bệnh truyền
nhiễm điều cơ bản là phải có môi trường cấy thuần khiết. Richard Julius Petri (1852-1921), làm việc tại Viện Vệ sinh của Koch là người
phát minh ra một chiếc đĩa đặc biệt dùng cho các môi trường cấy agar. Nhờ việc sử dụng rộng rãi đĩa Petri, các sinh viên ngành sinh học
quen thuộc với tên của Petri hơn là Robert Koch. Một vấn đề kỹ thuật khác mà Koch và các cộng sự giải quyết tại Văn Phòng Y tế Hoàng
gia là rà lại các biện pháp y tế công cộng, chẳng hạn như sự khử trùng (disinfection). Ngành vi sinh học giúp ta hiểu được sự khác nhau giữa
khử trùng (disinfection= giết các tế bào dạng sinh dưỡng, nhưng không nhất thiết phải diệt tất cả các bào tử), và tiệt trùng (sterilization =
giết hết thể sinh dưỡng và bào tử). Khi kiểm định hoạt tính của nhiều thứ thuốc sát trùng (antiseptics) có tiếng, Koch phát hiện rằng nhiều
thứ trước nay được ưa chuộng lại không hề có tác dụng khử trùng, trong khi đó nhiều chất được coi là sát trùng lại ức chế sự tăng sinh của
vi trùng nhưng không giết được chúng.
Khi Lister, Pasteur và Koch gặp nhau trong Hội nghị Y học quốc tế lần thứ 7 năm 1881 tại London,
Koch lợi dụng cơ hội để trình bày Kỹ thuật đĩa thạch của mình tại labô của Lister. Sau chuyến viếng
thăm đầy thắng lợi trở về, Koch bắt đầu nghiên cứu bệnh lao. Dồn hết mọi sức lực để tìm ra tác nhân gây
bệnh lao và tìm cách chữa chứng bệnh phổ biến này, Koch làm việc không hề biết mệt mỏi, giấu kín mọi
người. Vào tháng 3 năm 1882, trong một phiên họp tại Hội Sinh lý học Berlin, Koch tuyên bố là đã tìm
ra trực khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis. Tin tức về phát hiện của Koch đã làm nức lòng mọi
người khắp thế giới. Nhà vật lý học người Anh, John Tyndall (1820-1893), là một trong những người hết
lòng ủng hộ Pasteur, đã gởi thư đến tờ London Times công bố một bản tóm tắt công trình của Koch. Một
vài tuần sau, thư của Tyndall được in lại trong tờ New York Times. Các bài tường thuật và bình luận lập
tức chộp lấy ý kiến cho rằng với phát hiện của Koch chẳng bao lâu nữa người ta tìm được thuốc chữa
bệnh lao.
Koch hồi tưởng, trong thời đại vàng son của ngành vi trùng học, nhiều tác nhân vi trùng gây bệnh của
nhiều bệnh truyền nhiễm có vẻ rớt vào tay các nhà vi trùng học như thể “táo chín rụng từ trên cây
xuống” nhưng trực khuẩn lao lại không hề rụng dễ dàng. Trong tất cả các vi sinh vật mà Koch nghiên
cứu, trực khuẩn lao là con vi trùng được phát hiện, phân lập và nuôi cấy khó khăn nhất. Trên môi trường
thạch agar thích hợp, phần lớn các vi trùng đều cho khuẩn lạc trong vòng hai ngày; còn trực khuẩn lao
cần đến hai tuần mới cho các khuẩn lạc thấy được. Trong những nghiên cứu như thế này bắt buộc phải có
kỹ thuật vi sinh tốt nhất, môi trường nuôi cấy và kỹ thuật nhuộm đặc biệt, và động vật thí nghiệm phù
hợp. Nhưng Koch cũng tin rằng bệnh lao là một bệnh do vi trùng gây ra, ông ta hết sức tin tưởng rằng có
